文/寒波
既然咖啡因正是以咖啡為名，2014年這篇中果咖啡（Coffea canephora）基因組定序的論文[1]，標題除了咖啡基因組外，還加上「咖啡因生合成的趨同演化」，似乎是再自然也不過的事。可惜《咖啡為何要合成咖啡因？咖啡的基因體還說了什麼》一文對這篇論文的內容多有誤會，因此特別為文說明。
咖啡因製程的趨同演化
趨同演化的意思是，演化上沒有直接親緣關係的生物，卻擁有類似的特徵（也就是同功演化），例如鯨魚是哺乳類，與魚類不親，但兩者都演化出適應水生生活的身體構造。用鯨魚跟魚的身體構造舉例只是方便，事實上，趨同演化講的是特徵，不限於器官，因此不同種植物各自演化出製造咖啡因的能力，也是趨同演化。
圖一
什麼是「製造咖啡因的能力」？咖啡因是多種植物的次級代謝產物，光是在被子植物旗下的真雙子葉植物（eudicots）中，至少就有3種會合成咖啡因：咖啡、茶、可可。咖啡因是由xanthosine經歷4步化學反應，由4個不同酵素加工而成（見圖一），第一、第三、第四步的酵素，都屬於甲基轉移酶（N-methyltransferases ，縮寫NMTs），能製造咖啡因的植物，都配備這些替化合物加上甲基的酵素。
看看這些真雙子葉植物，彼此親緣關係接近的物種，只有一種能合成咖啡因，反而是親戚關係很遠的不同物種，各自能夠合成咖啡因（見圖二左），這有兩個可能：第一、這是沒有直接親戚關係的咖啡、茶、可可趨同演化所造成；第二、這些植物的共同祖先會製造咖啡因，只是後來大部分植物都喪失這個能力，只剩少數幾種保留了祖傳祕技。
圖二
怎麼知道製造咖啡因的能力是由不同物種獨立演化出來？這時候就要把不同植物參與合成咖啡因的基因，通通擺在一起畫演化樹，以咖啡來說，第一個加甲基的酵素叫作XMT，第二個叫MXMT，第三個是DXMT，這些酵素在其他植物中，步驟上都有其對應的酵素基因。
若是畫出演化樹做出來的親緣關係，不同植物的第一個酵素被歸成一群，第二個被歸成另一群，第三個也被歸成自己一群，那麼那麼就可以判斷，各種植物的共同祖先是先有這套製程，後來才分化成不同的種；反過來講，假如每種植物參與咖啡因製程的酵素，都各自成群，就意謂這些基因是植物分家以後才各自產生。
咖啡整個基因組定序後，發現能跟製造咖啡因的NMT（確定有5個）歸在一起的共有23個基因，茶與可可各自有6個基因參與其咖啡因製造，這一共35個基因的演化樹顯示，咖啡的23個自己一群，茶與可可各6個也獨自一群（見圖二右），意思是，這3種能合成咖啡因的植物，製程應該是各自獲得，也就是趨同演化的結果。
雖然這篇論文的表達法有點聳動，加上報導推波助瀾[2] [3] [4]，容易讓讀者誤會這次發現咖啡因製程的趨同演化，是對本來完全未知的大突破，不過其實早在2006年就有人做過類似的分析[5]，歷來也有數篇論文提過這個說法[6] [7]，只是以前的分析比較簡單，沒有這回這麼全面。
基因家族演化史：繁衍與搬家
基因怎麼來的？絕大多數基因，都是由已經存在的基因複製生成，可以追溯到同一個基因祖先複製而來的眾多基因，稱作基因家族（gene family），成員間彼此是「同源」的關係（可以跟趨同演化的「同功」關係對照），在咖啡中，參與咖啡因合成的NMT基因屬於一個有23位成員的大家族。
圖三
這23個基因，有13個基因分成3群，各自以串聯的方式排列，分佈在基因組不同的3個地方，第一號染色體上有兩群，一群5個（藍色），另一群4個（綠色），第三群4個則位於第九號染色體上（紅色）；另外10個則是散佈在基因組各處（見圖三左）。假如幾個同源基因在染色體上是串聯排列，演化樹上彼此的親緣關係又最接近，那麼就能合理的推測，它們當初是由串聯複製（tandem duplication）所生成。
由基因在染色體上的位置，以及彼此間的親緣關係，可以追溯這個基因家族演化的歷史：這3群基因一開始都位於第一號染色體（藍色），藉由串聯複製誕生，後來一部份位移到第九號染色體（紅色），另一部份位移到第一號染色體的其他地方（綠色），才變成我們今天看到的3群，它們雖然在染色體上位置隔很遠，彼此間的親緣關係卻很密切（見圖二右基因的顏色分佈）。
這些位移也導致咖啡幾個參與咖啡因合成的關鍵基因（CcXMT、CcMXMT、CcDXMT、CcMTL、CcNMT3），位於染色體上不同的位置，雖然基因隔很遠，但酵素產物當然還是可以一起工作，它們在咖啡各個部位與生命週期的表現量，也是全家族裡最高的（見圖三右）。
有利生存的演化力量：正向選汰
突變是造成生物體個體差異的來源，突變的效應可分為三種，有利、中性（沒有利也沒有害）、有害，假如完全沒有任何外力影響，突變會隨機發生並留在基因組中。然而現實是突變發生後，若是這個突變有害，改變是不好的，那麼帶有這個突變的個體不容易留下後代，這個突變也就不會保留在基因組中傳遞下去，這個過程稱為「淨化選汰（purifying selection）」，許多功能上很重要的基因都有這個特徵。
反過來，假如某個突變對生物有利，增加這些個體留下後代的機率，這時改變是好的，這個突變也因此有機會保留在這種生物的基因組中，甚至最終從小眾成為這種生物的主流，這個過程就是「正向選汰（positive selection）」。有很多種方法能計算DNA序列受到的外力影響，不同的方法，不同的比較對象，常會算出不一樣的結果。
這篇論文在偵測參與合成咖啡因的基因，受到何種演化外力影響時，是比較茶、可可、咖啡各自的NMT基因群，發現通往咖啡這群23個基因的分支有受到正向選汰的跡象，並借此推論獲得生成咖啡因的能力，在演化上對咖啡有利。
個人意見是，這個分析的確能告訴大家這「一整群23個基因的共同祖先」，在歷史上可能受過正向選汰，但這不等於「製造咖啡因的這條合成路徑」有受到正向選汰，畢竟正向選汰發生的時候，咖啡還沒有這條咖啡因生產線，要下這種結論，還需要更多分析。
比較合理的推論是，當初這些NMT基因的共同祖先，產生某些突變，可能有利咖啡的生存，後來這個基因在咖啡的基因組中大量串聯複製，產生很多咖啡限定的同源基因，這些複製品之後各自演化出不同功能，包括一條咖啡因的生產線。
總之，這篇論文的重點是定序出咖啡的基因組，並再度確認咖啡、茶、可可的咖啡因製程是趨同演化的產物，至於這些參與其中的基因怎麼改變，怎麼演化，就留待未來更多研究告訴我們了。
參考文獻：
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., … & Argout, X. (2014). The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science, 345(6201), 1181-1184.
- Coffee genome sheds light on the evolution of caffeine
- Coffee got its buzz by a different route than tea
- Coffee genome sequenced, caffeine genes abound
- Yoneyama, N., Morimoto, H., Ye, C. X., Ashihara, H., Mizuno, K., & Kato, M. (2006). Substrate specificity of N-methyltransferase involved in purine alkaloids synthesis is dependent upon one amino acid residue of the enzyme. Molecular Genetics and Genomics, 275(2), 125-135.
- Ashihara, H., Sano, H., & Crozier, A. (2008). Caffeine and related purine alkaloids: biosynthesis, catabolism, function and genetic engineering. Phytochemistry, 69(4), 841-856.
- Pichersky, E., & Lewinsohn, E. (2011). Convergent evolution in plant specialized metabolism. Annual review of plant biology, 62, 549-566.
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